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關(guān)于培養(yǎng)皿細(xì)菌培養(yǎng)的條件

我們在用培養(yǎng)皿設(shè)備細(xì)菌培養(yǎng)的時候，首先由于細(xì)菌無處不在，因此從制備培養(yǎng)基時開始，整個培養(yǎng)過程必須按無菌操作要求進(jìn)行，否則外界細(xì)菌污染標(biāo)本，會導(dǎo)致錯誤結(jié)果；而培養(yǎng)的致病菌一旦污染環(huán)境，就會引起交叉感染。?因此培養(yǎng)皿要經(jīng)過高溫滅菌，并且每一組的培養(yǎng)皿要在相同的環(huán)境條件下培養(yǎng)。經(jīng)過高溫處理后可以將培養(yǎng)皿上、培養(yǎng)基內(nèi)混有的細(xì)菌或真菌的孢子等殺死（經(jīng)過嚴(yán)格的高溫滅菌的環(huán)境中是不可能有細(xì)菌和真菌存在的），這樣就排除了實驗外其他環(huán)境的污染。?用培養(yǎng)皿設(shè)備培養(yǎng)時應(yīng)根據(jù)細(xì)菌種類和目的等選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基，制定培養(yǎng)條件（溫度、pH值、時間，對氧的需求與否等）。一般操作步驟為先將標(biāo)本接種于固體培養(yǎng)基上，做分離培養(yǎng)。再進(jìn)一步對所得單個菌落進(jìn)行形態(tài)、生化及血清學(xué)反應(yīng)鑒定。培養(yǎng)基常用牛肉湯、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、血液等和某些細(xì)菌所需的特殊物質(zhì)配制成液體、半固體、固體等。一般細(xì)菌可在有氧條件下，37℃中放18～24小時生長。厭氧菌則需在無氧環(huán)境中放2～3天后生長。個別細(xì)菌如結(jié)核菌要培養(yǎng)1個月之久。

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你的細(xì)菌培養(yǎng)物還在增長嗎?引物在OD-600進(jìn)行測量

細(xì)菌生長曲線綜述，讓我們先回顧一下細(xì)菌生長曲線的4個基本階段:log階段，滯后階段，靜止階段和死亡階段(圖1)。在此期間，細(xì)胞正在適應(yīng)和調(diào)整他們的新環(huán)境。然后，培養(yǎng)進(jìn)入對數(shù)期，在此期間，細(xì)胞迅速分裂，數(shù)量翻倍(大腸桿菌在對數(shù)期每20分鐘翻一番)。當(dāng)你在液體培養(yǎng)液中達(dá)到最大的細(xì)胞密度時，細(xì)胞就進(jìn)入了靜止期。在這一階段，細(xì)胞數(shù)量沒有整體增加——死亡的細(xì)胞被新分裂的細(xì)胞所取代，但活細(xì)胞的總數(shù)保持不變。如果你在研究孢子形成細(xì)菌，這可能是營養(yǎng)細(xì)胞孢子形成的階段，或形成新的孢子。最后，死亡(或下降)階段是由多種因素引起的，包括營養(yǎng)或氧氣的缺乏，細(xì)胞代謝引起的介質(zhì)pH值的變化，或有毒細(xì)胞廢物的積累。?使用OD600確定您的文化處于什么階段?最簡單的方法是測量OD600，或600納米的光密度，來測量一個培養(yǎng)基在其生長曲線上的距離。這種波長是專門為細(xì)菌OD測量而選擇的，因為與紫外線波長不同，600nm對培養(yǎng)物無害。這種波長通常也不會被像TSB和LB這樣的黃色介質(zhì)吸收。通過監(jiān)視OD600的增長速度，您可以確定培養(yǎng)物的滯后、記錄和固定相。?那么如何測量呢?對于一個簡單的懸浮在液體中的細(xì)胞，你首先需要零或“空白”的分光光度計與新鮮的，未接種的媒介減去媒介對測量的任何吸收貢獻(xiàn)。然后，取您的文化樣本并測量OD600。這種測量方法可以很容易地計算出培養(yǎng)瓶中每毫升培養(yǎng)細(xì)胞的總數(shù)。還不錯吧?盡管如此，還是有一些事情需要注意:?當(dāng)你提取一個培養(yǎng)基樣本時，確保你混合的很好，并立即進(jìn)行測量，因為細(xì)胞可以在一分鐘左右的時間內(nèi)開始沉淀，這將導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。?如果細(xì)菌在溶液中形成生物膜或聚集物，這將嚴(yán)重影響測量的準(zhǔn)確性和精度。在這種情況下，您可能需要對培養(yǎng)物進(jìn)行聲波降解或進(jìn)一步處理，以分解這些“簇”。查閱有關(guān)您正在使用的菌株的文獻(xiàn)，以避免或消除這個問題。?最重要的是，>1的OD值不準(zhǔn)確!這樣高的OD讀數(shù)超出了大多數(shù)分光光度計的動態(tài)范圍，這意味著這些讀數(shù)不會隨著細(xì)胞濃度的增加而線性增加。如果你得到的OD值大于1，稀釋你的樣品2倍或更多直到它達(dá)到OD600<1。?如果你經(jīng)常用燒瓶培養(yǎng)細(xì)菌，訓(xùn)練自己用眼睛估計OD值是有幫助的。這樣，當(dāng)燒瓶明顯不在您正在尋找的OD范圍內(nèi)時，跳過OD600檢查可以節(jié)省寶貴的時間。查看本文了解更多信息，并考慮使用微板閱讀器來提高OD測量的吞吐量。?其他監(jiān)測生長和代謝的方法?雖然使用一種培養(yǎng)物的OD600來監(jiān)測生長是一種久經(jīng)考驗的真實方法，但是還有其他幾種方法來評估細(xì)菌培養(yǎng)物的生長和代謝。您可能會發(fā)現(xiàn)其中一些因素對于您的特定應(yīng)用程序也更相關(guān)或有用!?通過采集培養(yǎng)物的樣本并在顯微鏡下進(jìn)行檢查，你可以開始對培養(yǎng)物中活細(xì)胞的近似濃度有一個了解。額外的好處:你可以比較細(xì)胞的圖片，看看是否有不同的形態(tài)學(xué)批次，或多少營養(yǎng)細(xì)胞在一個孢子形成培養(yǎng)。?溶解氧和二氧化碳?？紤]啤酒(由酵母制成)，康普茶(由酵母和各種細(xì)菌制成)，以及其他由微生物發(fā)酵的飲料。在這些例子中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氧氣(O2)被消耗，二氧化碳(CO2)被形成。同樣的過程發(fā)生在有氧培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)中!溶解O2和CO2探頭是生物反應(yīng)器中常用的探頭。如果你想要一個微創(chuàng)的選擇,光學(xué)傳感器(和補(bǔ)丁)存在,使用LED熒光監(jiān)控溶解-2從外面瓶啊!?大多數(shù)細(xì)菌隨著時間的推移會降低培養(yǎng)基的pH值，包括大腸桿菌。對于某些物種來說，酸的產(chǎn)生實際上會限制一個文化的最大生長和生存能力。與氧傳感器一樣，有方法可以對燒瓶中的pH值進(jìn)行無創(chuàng)連續(xù)監(jiān)測。?糖的分析。有了某些儀器，從生長培養(yǎng)基中快速可靠地測定殘余糖分是可能的。例如，如果你的培養(yǎng)基中主要的碳源是葡萄糖，在細(xì)菌生長的中途獲取葡萄糖測量數(shù)據(jù)可以讓你了解培養(yǎng)基在生長曲線中的位置。?那么你應(yīng)該在什么時候收獲一種文化呢??簡而言之，這完全取決于文化的最終目標(biāo)是什么。例如，我曾經(jīng)大量培育和誘導(dǎo)大腸桿菌過度表達(dá)非本地蛋白，然后從培養(yǎng)中純化。我經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，我從培養(yǎng)物中獲得的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量取決于我收獲時的相細(xì)胞。然而，在其他情況下，目標(biāo)只是盡可能多的獲取細(xì)胞。?一旦你知道了需要采集細(xì)胞的特定生長階段，一定要進(jìn)行一些測試(包括測量)，以確保你對細(xì)菌生長時間的評估是正確的。這將給你一個強(qiáng)烈的感覺，你的文化需要多長時間準(zhǔn)備收獲，并提供歷史數(shù)據(jù)比較增長曲線。始終從一個較小的“種子”文化開始，以獲得可靠的和持續(xù)增長的燒瓶。最后，如果你不太適應(yīng)減少污染的風(fēng)險，可以測試你的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)幾次。

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離心管的介紹及使用規(guī)范

離心管英文名稱：centrifugaltube定義：管狀試樣容器，可帶密封蓋或壓蓋。所屬學(xué)科：機(jī)械工程（一級學(xué)科）；實驗室儀器和裝置（二級學(xué)科）；實驗室離心機(jī)-實驗室離心機(jī)零部件及附件（三級學(xué)科）??按照大小大量離心管（500mL、250mL）普通離心管（50mL、25mL、15mL、10mL）微量離心管（2mL、1.5mL、0.65mL、0.2mL、5mL、7mL、0.5mL）?按照材料塑料離心管，玻璃離心管，鋼制離心管1、塑料離心管塑料離心管的優(yōu)點是透明或者是半透明的，它的硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。塑料離心管都有管蓋，它的作用是防止樣品外泄，尤其是用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時防止樣品外泄是很重要的一點；管蓋還有一個作用是防止樣品揮發(fā)以及支持離心管，防止離心管變形。在挑選這一點的時候還要注意檢查管蓋是否嚴(yán)密，在試驗時能否蓋嚴(yán)，以到達(dá)倒置不漏液；我們都知道在塑料離心管中，常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中聚丙烯PP管性能會相對較好，所以，我們在挑選塑料離心管時盡可能的考慮聚丙烯的塑料離心管。2、玻璃離心管使用玻璃管時離心力不宜過大，需要墊橡膠墊，防止管子破碎，高速離心機(jī)一般不選用玻璃管。離心管蓋子封閉性不夠好，液體就不能加滿（針對高速離心機(jī)且使用角轉(zhuǎn)子）以防外溢，失去平衡。外溢后果是污染轉(zhuǎn)子和離心腔，影響感應(yīng)器正常工作。超速離心時，液體一定要加滿離心管，因為超離需要抽高真空，只有加滿才能避免離心管變形。3、鋼制離心管而鋼制離心管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕，它的應(yīng)用也是相當(dāng)廣泛但使用時同樣也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。盡量避免這些化學(xué)物質(zhì)的腐蝕。管蓋的作用：1、用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時，防止樣品外泄?！?、防止樣品揮發(fā)。　3、支持離心管，防止離心管變形。在生物科學(xué)，特別是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室都要準(zhǔn)備多種型式的離心機(jī)。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液盛放在離心管中在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（如細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離?；驹恚寒?dāng)一個粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，　即：　F=ma=mω2r　a—粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m—沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。　通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來表示，因而稱為相對離心力“RCF”?；蛘哂脭?shù)字乘“g”來表示　例如25000×g，則表示相對離心力為25000。

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